분자생물학관련 단백질, DNA 농도 변환 프로그램

분자생물학과 관련된 프로그램 중에 아래의 사이트에 소개된 프로그램은 여러가지로 유용합니다.
   

1. Conversion: weight - moles (for proteins).
   분자량을 알고 있는 단백질의 농도를 측정한 다음 그 무게와 농도를 변환해 주는 프로그램입니다.

2. Conversion: weight - moles (for nucleic acids).
   DNA, RNA 등 핵산의 길이와 농도를 변환해주는 프로그램입니다.

3. Conversion: DNA - protein.
  유전자의 길이와 단백질의 분자량을 추정해주는 프로그램입니다. 사실 이건 간단한 계산이죠.^^

4. Conversion: molar quantity - molar concentration.
  몰 농도와 몰랄농도의 변환 프로그램입니다.

    
그런데 더 좋은 것은 위의 프로그램을 다운받아서 자기 컴에서 사용할 수 있다는 것입니다. 무슨 인스톨도 필요없습니다. 그냥 압출화일 받아서 풀어놓고 index.html 실행하면 끝이에요. 한 번 해보시기 바랍니다.

English version only ( Zip file, size - 1Mb).

Protein maturation; N-terminal Methionine Excision (NME)

단백질이 만들어지는 translation 과정의 첫번째 아미노산은 Met (methionine)입니다. 보통 Eukayrotes의 경우는 methionine이고 prokaryotes의 경우는 N-formyl-Met (fMet)이죠. 하지만 실제 단백질이 다 만들어진 다음에 보면 첫번째 아미노산이 Met이 아닌 경우가 많습니다. 대장균의 경우는 약 50%이상의 단백질에서 첫번째 아미노산이 Met이 아닌 다른 아미노산이 발견된다고 합니다. 이렇게 N-terminal Met이 잘라져 나가는 현상을 N-terminal Methionine Excision (NME)하고 하는데 거의 모든 생물종에서 나타나는 현상입니다.

이와 같이 translation 후 단백질이 functional form으로 변하는 과정을 protein maturation이라고 하는데 그 중에서 단백질의 N-말단에서 벌어지는 일들은 보통 다음과 같은 과정을 포함합니다. 

1. Deformylation by Peptide Deformylase (PDF) in Bacteria only
2. N-terminal Methionine Excision (NME) by Methionine aminopeptidase (MAP) in all organisms
3. N-terminal Acetylation by N-terminal acetyltransferase (NAT) mainly in Archaea and Eukarya.

아래 그림은 최근 발표된 Archaea의 N-terminal Acetylation에 관한 논문 (J Mol Biol. 2006 Oct 6;362(5):915-924)의 그림입니다. 아래에서보시는 바와 같은 과정이 N-말단에서 일어나는 protein의 maturation 과정입니다.

Figure 1. (a) Major N-terminal protein processing steps in the three domains of life (black, archaea; dark grey, eukaryota; light grey, bacteria). The ATG (or another) start codon is translated directly to methionine (archaea, eukaryota) or to formyl-methionine (f-Met) with subsequent deformylation (bacteria). The initial methionine may remain unprocessed (N1, yellow) or may be cleaved (N2, green). Subsequent N-terminal acetylation may affect the initial methionine (Ac1, light blue) or the newly uncovered N-terminal residue (here represented as serine) (Ac2, dark blue). The relative proportion of the modifications in the three domains of life is indicated by the thickness of the arrow (thick, common; thin, less common; dotted, exceptional). (b) Start codon usage, (c) the extent of initial methionine cleavage, and (d) the extent of N-terminal acetylation in H. salinarum (cake diagrams and values) and N. pharaonis (values in parenthesis). In (c), N1 (which includes Ac1) is indicated in yellow and N2 (which includes Ac2) is coloured in green. Partial cleavage is indicated in light green. In (d), N1 is indicated in yellow, N2 in green, Ac1 in light blue and Ac2 in dark blue as in (a). The statistics presented have been compiled from protein set 3 ((a) and (b)) and the reduced protein set 3.2 (c) (see Methods). Further details are given in Supplementary Data, Table 5.

이 중에서 MAP의 경우는 Met 다음의 아미노산이 어떤 것이 오는가에 따라 활성에 제약을 받습니다. 일반적으로 반경이 1.29 A(옹스트롬)보다 작으면 박테리아, 아키아, 유캐리아 MAP이 인식 가능하고 메치오닌을 제거합니다. 아래는 대장균 MAP의 아미노산에 따른 기질특이성입니다.  

일반적으로 Eukaria에서 나타나는 N-terminal myristoylation의 경우는 N-말단의 Gly잔기에 일어나는데 이 경우에는 보통 Met 다음 잔기가  Gly이고 MAP에 의해 Met이 제거된 다음에 myristoylation이 일어납니다. MAP과 myristoylation모두 co-translational modification이라고 볼 수 있습니다.

관련링크

1. 대장균에서의 NME 현상; J Mol Biol. 1963 Nov;62:483-96
2. 효모에서의 MAP 활성; J Biol Chem. 1985 May 10;260(9):5382-91
3. 대장균에서의 MAP 활성; J Bacteriol. 1987 Feb;169(2):751-7
4. Archaea에서 N-terminal acetylation; J Mol Biol. 2006 Oct 6;362(5):915-924
5. NME review; Cell Mol Life Sci. 2004 Jun;61(12):1455-74
6. MAP review; FEMS Microbiol Rev. 1996 Jul;18(4):319-44

쿠마씨 (Coomassie Brilliant Blue) 염색은 어떤 아미노산에 되는가?

가끔은 너무나 기본적인 것이 생각 안나서 괴로울 때가 있습니다. 쿠마씨 염색의 원리 같은 것이 그렇습니다.

단백질을 전기영동해서 염색할 때 가장 많이 사용하는 염색약이 쿠마씨 염색입니다. 보통 쿠마씨는 "Coomassie Brilliant Blue G 250"이라는 염색약을 뜻합니다. 화학구조는 왼쪽에 보시는 것과 같습니다.

(그림은 위키에서 가져왔습니다.)







단백질이 염색이 되는 원리는 이 시약이 단백질의 Arg, Lys이나 aromatic ring이 있는 아미노산 잔기들 (Tyr, Trp, Phe), His등과 결합을 하기 때문이라고 합니다.

조금 더 자세히 말하면

위의 그림에서 보시다시피 쿠마씨는 6개의 phenyl group들과 2개의 sulfonic acid group들을 통해서 단백질과 결합하는데 소수성 결합 (hydrophobic interaction with Try, Tyr, His, Phen)과 반데르발스 결합 (electrostatic force with Arg and Lys)을 통해 결합을 합니다. Arg에 반응하는 양이 aromatic ring을 가진 아미노산 잔기보다 8배 높습니다.  

꽃송이버섯의 항암성분은 베타글루칸

재미있는 뉴스가 있습니다. "꽃송이버섯’ 항암효과 진실 풀렸다"는 뉴스입니다. 며칠전에는 다른 언론에서도 소개가 된 적이 있습니다.

‘네이처’誌가 주목한 새 항암치료제 ‘꽃송이버섯’ (신동아)

[박태균기자의약선] 항암 효과 탁월 베타 글루칸  (중앙일보)

본문중의 일부분만 인용해 보면 베타글루칸의 함량은,

꽃송이버섯(100g당 43.6g).
잎새버섯(15~20g).
영지버섯(8~15g).
느타리버섯(7~12g).
송이버섯(18.1g).
아가리쿠스(11.6g)

등으로 조사되었다고 합니다.

이 뉴스와 관련된 논문은 네이처 이뮤놀로지 지난 1월호에 두 편이 연달아 실렸군요. 네이처에서도 특집으로 다웠다네요. 논문은 나중에 읽어보고 리뷰해보도록 하죠.

Dectin-1 is required for -glucan recognition and control of fungal infection pp31 - 38
Philip R Taylor, S Vicky Tsoni, Janet A Willment, Kevin M Dennehy, Marcela Rosas, Helen Findon, Ken Haynes, Chad Steele, Marina Botto, Siamon Gordon & Gordon D Brown
Published online: 10 December 2006 | doi:10.1038/ni1408
Abstract | Full text | PDF (474K)  | Supplementary Information
See also: News and Views by Dostert & Tschopp | Article by Saijo et al.
Dectin-1 is required for host defense against Pneumocystis carinii but not against Candida albicans pp39 - 46
Shinobu Saijo, Noriyuki Fujikado, Takahisa Furuta, Soo-hyun Chung, Hayato Kotaki, Keisuke Seki, Katsuko Sudo, Shizuo Akira, Yoshiyuki Adachi, Naohito Ohno, Takeshi Kinjo, Kiwamu Nakamura, Kazuyoshi Kawakami & Yoichiro Iwakura
Published online: 10 December 2006 | doi:10.1038/ni1425
Abstract | Full text | PDF (386K)  | Supplementary Information
See also: News and Views by Dostert & Tschopp | Article by Taylor et al.
 

(사진출처: 신동아)

단백질 등전점이나 분자량 구하는 프로그램

의외로 제 홈페이지를 찾으시는 분들의 상당수가 등전점에 대한 검색을 하시는 분들이더군요. 그 중에 등전점 구하는 방법을 찾는 분들이 꽤 계시던데 간단한 방법을 알려드리죠.

단백질의 여러가지 parameter들을 구하는 프로그램은 수없이 많이 나와있습니다. 그런 프로그램을 자기 컴에다 깔아놓고 쓰시는 분들도 많지만 저는 그냥 온라인 상에서 이용할 수 있는 프로그램을 선호합니다. 그 중에서 제가 가장 애용하는 프로그램은 ExPASy의 ProtParam입니다.

일단 위의 사이트에 접속하시면 다음과 같은 화면이 뜹니다.

저 첫번째 입력창은 무시하셔도 상관없고 두번째 창에 아미노산 시퀀스를 갖다 붙이세요. 물론 one character로 된 시퀀스여야 합니다. 그리고 compute parameters를 누르시면 끝입니다. 그러면 나오는 결과들은,

1) Number of amino acids:
2) Molecular weight:
3) Theoretical pI:
4) Amino acid composition:
5) Total number of negatively charged residues (Asp + Glu):
6) Total number of positively charged residues (Arg + Lys):
7) Atomic composition:
8) Formula (분자식)
9) Total number of atoms:
10) Extinction coefficients (Extinction coefficients are in units of  M-1 cm-1, at 280 nm measured in water)
11) Estimated half-life:
12) The N-terminal of the sequence considered is M (Met).
13) Instability index
14) Aliphatic index
15) Grand average of hydropathicity (GRAVY)

등이 계산되어 나옵니다. 각각의 파라미터는 나름대로의 의미가 있지만 특히 분자량, 등전점(pI), extinction coefficient (대략적인 단백질 농도 측정시 사용) 등이 가장 많이 사용하는 파라미터들입니다.



 

Ni-NTA His-tag affinity chromatography

아마 모든 실험실에서 가장 많이 사용하는 단백질 정제 방법이 히스티틴 tag을 이용한 affinity 크로마토그래피일 것입니다. 이미 여러회사에서 상용화된 수지(resin)을 팔고 있습니다. 물론 값은 엄청나게 비쌉니다. 그 중 가장 많이 사용하는 Qiagen의 Ni-NTA superflow수지는 500ml에 3800불이나 합니다.
 
NTA는Nitrilotriacetic acid의 약자로서 분자식이 C6H9NO6입니다. NTA는 대표적인 메탈 킬레이터인 EDTA와 비슷한 성질을 갖는데 자연에서 잘 분해가 안되는 EDTA에 비해 쉽게 분해되기 때문에 장점이 있습니다.

(위 사진은 wiki에서 가져온 NTA)
 
이 NTA는 다양한 금속이온을 킬레이팅 하기 때문에 거기에 Ni을 붙이고 지지체와 연결시킨 것이 Ni-NTA resin입니다. 아래 그림에서 보시는 바와 같이 Ni 이온은 히스티딘의 이미다졸링과 배위공유결합을 할 수 있습니다. 하지만 고농도 (약 300mM)의 free imidazole을 넣어주면 히스티딘이 유리되어 단백질이 떨어져 나오는 것입니다.  

(위 그림은 www.nanoprobes.com 에서 가져왔습니다.)

아미노산의 하나인 히스티딘은 아래 그림에서 보듯이 side chain에 이미다졸 링을 가지고 있습니다. 그래서 Arginine, Lysine과 더불어 양전하를 띄는 염기성 아미노산입니다. 하지만 사이드 체인의 pKa 값이 6.0이기 때문에 실제로 pH6 이상에서는 양전하를 띄지 않고 중성입니다. 그래서 남은 전자를 Ni 이온과의 배위결합에 이용합니다.

 

단백질과 pI (isoelectric point, 등전점), 이온교환수지 선택

아미노산은 pH에 따라 산과 염기로 이온화가 가능한 물질입니다. 따라서 아미노산의 결합체인 단백질도 pH에 따라 자기 고유의 전하를 띄게 됩니다. 보통 단백질의 net charge는 pH에 따라 달라지는데 이렇게 단백질의 net charge가 0이 되는 pH를 그 단백질의 등전점 (isoelectric point, pI)라고 부릅니다. 보통 단백질의 net charge는 전체 아미노산보다는 단백질 표면의 아미노산이 더 중요한 영향을 주지만 구조를 모르는 상황에서 등전점을 구하기 위해 아미노산 구성만을 가지고 이론적 pI (Theoretical pI)를 계산하기도 합니다.

주의할 것은 단백질을 pI 에 해당하는 buffer pH에 보관하면 버퍼에 녹지않고 침전이 생긴다는 점입니다. 그래서 등전점 보다는 높거나 낮은 버퍼에서 정제 등의 작업을 하는 것이 일반적입니다. 보통 등전점보다 높은 pH로 가면 단백질은 음전하를 띠고 등전점보다 낮은 pH에서는 양전하를 띕니다. 그래서 Native page를 걸 경우 각각의 전하에 따라 이동하는 방향이 다르기 때문에 전극의 방향을 주의해야 합니다.

또한 이온교환 수지를 이용해서 정제를 할 경우 양이온교환수지 (Pharmacia Q 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 높은 pH의 버퍼를, 음이온 교환수지 (Pharmacia SP 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 낮은 pH의 버퍼를 사용해야 합니다.

정리하자면 버퍼 pH가,

등전점보다 높으면 ---> 음전하 ---> 음이온교환수지 (Q, DEAE)
등전점보다 낮으면 ---> 양전하 ---> 양이온교환수지 (SP, CM)

이온교환에 대한 기본적인 이론에 대해서는 다음의 사이트를 참고하시면 도움이 될 겁니다.

http://www.proteinchemist.com/tutorial/iec.html