Ni-NTA His-tag affinity chromatography

아마 모든 실험실에서 가장 많이 사용하는 단백질 정제 방법이 히스티틴 tag을 이용한 affinity 크로마토그래피일 것입니다. 이미 여러회사에서 상용화된 수지(resin)을 팔고 있습니다. 물론 값은 엄청나게 비쌉니다. 그 중 가장 많이 사용하는 Qiagen의 Ni-NTA superflow수지는 500ml에 3800불이나 합니다.
 
NTA는Nitrilotriacetic acid의 약자로서 분자식이 C6H9NO6입니다. NTA는 대표적인 메탈 킬레이터인 EDTA와 비슷한 성질을 갖는데 자연에서 잘 분해가 안되는 EDTA에 비해 쉽게 분해되기 때문에 장점이 있습니다.

(위 사진은 wiki에서 가져온 NTA)
 
이 NTA는 다양한 금속이온을 킬레이팅 하기 때문에 거기에 Ni을 붙이고 지지체와 연결시킨 것이 Ni-NTA resin입니다. 아래 그림에서 보시는 바와 같이 Ni 이온은 히스티딘의 이미다졸링과 배위공유결합을 할 수 있습니다. 하지만 고농도 (약 300mM)의 free imidazole을 넣어주면 히스티딘이 유리되어 단백질이 떨어져 나오는 것입니다.  

(위 그림은 www.nanoprobes.com 에서 가져왔습니다.)

아미노산의 하나인 히스티딘은 아래 그림에서 보듯이 side chain에 이미다졸 링을 가지고 있습니다. 그래서 Arginine, Lysine과 더불어 양전하를 띄는 염기성 아미노산입니다. 하지만 사이드 체인의 pKa 값이 6.0이기 때문에 실제로 pH6 이상에서는 양전하를 띄지 않고 중성입니다. 그래서 남은 전자를 Ni 이온과의 배위결합에 이용합니다.

 

단백질과 pI (isoelectric point, 등전점), 이온교환수지 선택

아미노산은 pH에 따라 산과 염기로 이온화가 가능한 물질입니다. 따라서 아미노산의 결합체인 단백질도 pH에 따라 자기 고유의 전하를 띄게 됩니다. 보통 단백질의 net charge는 pH에 따라 달라지는데 이렇게 단백질의 net charge가 0이 되는 pH를 그 단백질의 등전점 (isoelectric point, pI)라고 부릅니다. 보통 단백질의 net charge는 전체 아미노산보다는 단백질 표면의 아미노산이 더 중요한 영향을 주지만 구조를 모르는 상황에서 등전점을 구하기 위해 아미노산 구성만을 가지고 이론적 pI (Theoretical pI)를 계산하기도 합니다.

주의할 것은 단백질을 pI 에 해당하는 buffer pH에 보관하면 버퍼에 녹지않고 침전이 생긴다는 점입니다. 그래서 등전점 보다는 높거나 낮은 버퍼에서 정제 등의 작업을 하는 것이 일반적입니다. 보통 등전점보다 높은 pH로 가면 단백질은 음전하를 띠고 등전점보다 낮은 pH에서는 양전하를 띕니다. 그래서 Native page를 걸 경우 각각의 전하에 따라 이동하는 방향이 다르기 때문에 전극의 방향을 주의해야 합니다.

또한 이온교환 수지를 이용해서 정제를 할 경우 양이온교환수지 (Pharmacia Q 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 높은 pH의 버퍼를, 음이온 교환수지 (Pharmacia SP 컬럼)를 이용하려면 등전점보다 낮은 pH의 버퍼를 사용해야 합니다.

정리하자면 버퍼 pH가,

등전점보다 높으면 ---> 음전하 ---> 음이온교환수지 (Q, DEAE)
등전점보다 낮으면 ---> 양전하 ---> 양이온교환수지 (SP, CM)

이온교환에 대한 기본적인 이론에 대해서는 다음의 사이트를 참고하시면 도움이 될 겁니다.

http://www.proteinchemist.com/tutorial/iec.html